肾纤维化是慢性肾病（CKD）发展的核心病理特征之一，表现为肾间质细胞外基质（ECM）的异常沉积和成纤维细胞的持续激活，严重影响患者的肾功能和生活质量。在众多促纤维化因子中，转化生长因子-β1（TGF-β1）是公认的肾纤维化主要调控因子。因此，靶向TGF-β1及其下游分子一直被认为是抗CKD药物开发的重要方向和策略。在长期的生活实践中，大量的传统草药已被用于治疗纤维化相关疾病，然而其有效成分及分子机制尚未被完全阐明。黄芫花(Wikstroemia chamaedaphne)因富含抗纤维化天然产物（NPs）被广泛用于民间药物治疗水肿（肾脏相关疾病最突出的表现之一）。为此，中山大学第一附属医院研究团队围绕黄芫花展开研究，发现黄芫花粗提物（CE） 在减轻肾纤维化方面表现出显著效果。进一步分离得到的化合物15（dapnepeduin A, DA）通过靶向Cdc42介导GSK-3β/β-catenin信号通路能够减弱肾纤维化。从而揭示了DA作为一种天然来源的小分子抗纤维化药物的巨大潜力，为肾纤维化的治疗提供了新的分子靶点和策略。百泰派克生物科技凭借先进的肾脏组织分析技术，为解析肾脏疾病的分子机制、筛选潜在靶点以及评价药物疗效提供了有力支持。下面跟随小编一起来看看这项研究吧~
1、DA作为肾成纤维细胞活化有效抑制剂的发现
研究观察到黄芫花粗提物（CE）显著减轻小鼠肾纤维化，如图1A所示。在图1B中，TGF‐β1稳定诱导肾成纤维细胞中α‐SMA的表达和ECM的产生，而CE从5µg/mL开始导致这些纤维化指标的表达呈剂量依赖性下降，表明其抑制肾成纤维细胞的激活的有效活性。
为了进一步追踪CE中的活性成分，研究人员对其进行了分离并分离出16种二萜（1-16），其中化合物15 （dapnepeduin A，DA）的活性最强。在ECM方面，DA在候选化合物中对纤维连接蛋白和I型胶原的抑制效率也最为突出（图1D）。同时，在MTS实验中，DA对成纤维细胞呈低毒性，在10µM时细胞存活率为>90%。因此，考虑到疗效和安全性，研究人员选择DA作为有前景的先导物进行进一步的研究。该化合物以剂量和时间依赖性的方式降低了纤维化标志物的表达（图1E，F）。
综上所述，证明黄芫花的主要成分DA可以显著抑制肾成纤维细胞的激活和ECM的产生。
图1. 在TGF-β1激活的肾成纤维细胞中，DA作为一种有效的抗纤维化化合物
2、DA抑制肾小管细胞上皮-间充质转化成纤维细胞的活化
活化的肾纤维细胞具有增强增殖和迁移能力，导致肾纤维化病变的产生。因此，研究人员接下来对DA在活化的肾纤维细胞中的作用进行了探究。通过对TGF-β1、血管紧张素II、白细胞介素17、脂多糖、白细胞介素-1β等诱导的肾纤维细胞中α-SMA和ECM表达进行研究发现，DA阻断了α-SMA和ECM的表达且展现出对活化纤维细胞的增殖和迁移能力的抑制作用。同时，DA还被发现能够抑制上皮间质转化（EMT）的发生，恢复上皮标记物E-钙黏蛋白的表达并降低基质标记物（纤连蛋白和微丝蛋白）的表达。DA展现出显著的抗纤维化活性。
图2. DA阻断肾成纤维细胞的活化和肾小管细胞的EMT
3、DA减轻UUO小鼠肾纤维化模型
为了评估DA在体内的抗纤维化作用，研究采用了UUO小鼠模型，手术后7天给予低剂量（LD）和高剂量（HD）DA。与对照组相比，DA显著下调了UUO小鼠肾脏中Acta2（编码α‐SMA）、Col1a1、Col3a1（编码胶原）和Fn1（编码纤维连接蛋白）mRNA水平以及相应的蛋白质水平（图3A，B）。低剂量DA组在减少这些纤维化调节因子方面取得了与PFD组（阳性对照组）相似的效力。高剂量DA比PFD组表现出更好的效率，这支持了DA强大的抗肾纤维化活性。从血清肝酶（天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT））水平和体重下降可以看出，DA给药并未诱导小鼠明显的全身毒性（图3D，E）。
将药物分配到预定的部位对于提高疗效和减少副作用至关重要，因此研究采用了广泛使用的高效液相色谱-串联质谱（HPLC - MS/MS）方法来检测不同器官中的含量。如图3F所示，在肾脏和肝脏中，在色谱上都发现了DA的峰，并且DA在肾脏中似乎更富集；肺、心、脾均未见DA峰。
综上所述，DA是一种有效的肾保护剂，可在体内减轻小管间质纤维化，具有较高的疗效和安全性。
图3. DA对UUO小鼠肾纤维化有保护作用
4、DA减少活化成纤维细胞中β-Catenin的积累
为了阐明DA抗纤维化作用的分子机制，研究进行了转录组测序。结果显示，两组差异表达基因1593个，经DA处理后基因上调1074个，下调519个（图4A）。KEGG分析显示，DA对Wnt信号通路发挥了显著作用，而不是假定的促纤维化TGF-β/Smads信号通路（图4B）。DA阻断TGF-β1诱导的β-catenin上调（图4C）。发现DA显著抑制TGF-β1刺激的β-catenin细胞质和细胞核积累，Wnt/β-catenin信号激活的主要特征以及纤维化基因转录（图4D，E）。同时，在多个肾成纤维细胞和小管细胞模型中检测到DA对各种刺激诱导的β-catenin水平的抑制作用。这些发现进一步支持了DA抑制β-catenin对抗肾纤维化。
图4. DA促进了β-catenin在S33/37/45/T41位点的磷酸化，并促进β-catenin泛素化降解
DA增加了肾成纤维细胞中β-catenin (Ctnnb1) 的mRNA水平，因此假设DA介导的β-catenin的下调可能是由于蛋白质降解。经验证，DA能促进β-catenin水解（图4F）。此外，研究团队还分析了DA对β-catenin泛素化修饰的影响，结果显示DA处理可挽救TGF-β1还原的β-catenin泛素化（图4G）。β-catenin的泛素化蛋白水解受到特定位点磷酸化状态的严格控制，例如Ser33/37/45和Thr41位点，研究发现TGF-β1显著降低了β-catenin在Ser33/37/45/Thr41位点的磷酸化，这可以被DA拮抗从而促进β-catenin的降解（图4H）。这些研究结果表明，DA通过上调β-catenin 在Ser33/37/45/Thr41残基的磷酸化促进了β-catenin的泛素化蛋白水解。
这些观察结果表明，DA的抗纤维化活性主要依赖于对促纤维化β-catenin信号通路的阻断。
5、DA减轻UUO小鼠肾纤维化模型
为了验证DA在体内是否也靶向β-catenin信号传导，研究团队评估了用载体或DA处理的UUO小鼠肾脏中总β-catenin和磷酸化水平。与培养成纤维细胞的结果一致，DA以剂量依赖的方式降低了UUO肾脏中β-catenin的表达（图5A）。同时，DA处理可以挽救UUO样品中β-catenin促降解磷酸化Ser33/37/45/Thr41位点的减少，支持DA促进体内β-catenin泛素化蛋白水解的假设（图5B）。免疫组织化学染色显示，在纤维化肾脏中β-catenin升高主要位于小管和小管间质，可以通过给药DA消除（图5C）。高剂量DA使UUO肾脏恢复到接近健康小鼠的水平。
图5. DA增加了UUO肾脏中p-β-catenin (S33/37/45/T41)，降低了总β-catenin含量
6、DA通过抑制Cdc42活性阻断促纤维化β-Catenin信号传导
研究采用热蛋白组学策略进一步研究了DA阻断纤维化促进的β-catenin信号通路的药理机制。通过筛选确定了Cdc42可能是DA的靶标蛋白，并发现Cdc42在细胞质中起着重要的信号转导作用。随后通过活性Cdc42 pull-down实验、细胞热转移实验（CETSA）、表面等离子共振（SPR）等验证了这一结果。此外，利用分子对接和残基突变实验发现Leu119和Lys128是DA与Cdc42结合的关键位点。这些发现进一步揭示了DA的药理机制。
图6. DA直接与Cdc42结合并抑制其活性
7、DA依赖Cdc42调控p-PKCζ/p-GSK-3β/β-catenin轴并发挥抗纤维化活性
使用小干扰 RNA 耗尽成纤维细胞中的Cdc42，此时DA对纤维化的抑制作用减弱；Cdc42过表达可持续促进肾成纤维细胞的活化并阻断了DA的抗纤维化能力，表明DA的药效靶点为Cdc42。已知Cdc42 缺失会促进 β-catenin降解，该过程由蛋白激酶Cζ (p-PKCζ )和糖原合酶激酶 3β (p-GSK-3β) 磷酸化减少介导。p-GSK-3β 的减少实际上对应于 GSK-3β 的增加，后者通过在 Ser33/37/Thr41 处磷酸化 β-catenin 引发蛋白水解。因此研究假设Cdc42通过调节p-PKCζ/p-GSK-3β/β-catenin轴来调节肾成纤维细胞活化。验证的结果与假设结果一致。
图7. DA通过靶向Cdc42激活了p-PCKζ/p-GSK-3β介导的S33/37/T41位点的β-catenin磷酸化
8、Cdc42表达升高与小鼠和人肾纤维化相关
为了揭示Cdc42与CKD患者肾纤维化的临床相关性，研究查询了公共基因表达谱，发现CKD患者的Cdc42转录水平远高于健康供者（图8B）。此外，Cdc42与纤维化基因Acta2、Col1a、Col3a1、Fn1的表达呈显著正相关（图8C）。CKD患者和健康对照者的肾脏标本免疫组化结果显示，在健康肾脏中，Cdc42在小管和肾小球中少量表达，而在小管间质室中几乎检测不到。相比之下，在CKD患者肾脏的小管、肾小球和间质中检测到Cdc42的显著增加（图8D），暗示Cdc42参与肾脏纤维化。综上所述，这些结果表明Cdc42的高表达与肾纤维化密切相关，因此药物抑制Cdc42可能有益于CKD患者。
图8. Cdc42在UUO小鼠和CKD患者中均有较高的表达
研究结论：
DA是一种天然的小分子二萜，它从药用植物黄芫花中分离出来，是一种高效的抗纤维化药物，能够阻断肾成纤维细胞的激活，减轻小鼠模型中的肾纤维化，它比阳性对照吡非尼酮更有效。从机制上说，DA与Cdc42结合并抑制其活性，从而降低下游p-PKCζ和p-GSK-3β水平，导致p-β-catenin （Ser33/37/Thr41）上调，并通过泛素-蛋白酶体途径对β-catenin进行蛋白降解。
在未来的肾纤维化研究与治疗中，天然产物的深入挖掘与靶向Cdc42介导的GSK-3β/β-连环蛋白信号通路的精准调控将为慢性肾病（CKD）的防治带来新的希望。百泰派克生物科技作为生物质谱领域的先行者，拥有专业的技术团队和7大质量控制检测平台，采用ISO9001认证质量控制体系管理实验室，获国家CNAS实验室认可，我们能够实现对肾脏组织的高分辨率解析，精确揭示不同细胞群体在肾纤维化过程中的动态变化和信号通路调控机制。我们诚挚邀请各界科研伙伴与我们携手合作，共同揭示肾纤维化的深层机制，探索更具针对性和有效性的治疗策略，为全球肾脏疾病患者带来福音。
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参考文献：
Hu X, Gan L, Tang Z, Lin R, Liang Z, Li F, Zhu C, Han X, Zheng R, Shen J, Yu J, Luo N, Peng W, Tan J, Li X, Fan J, Wen Q, Wang X, Li J, Zheng X, Liu Q, Guo J, Shi GP, Mao H, Chen W, Yin S, Zhou Y. A Natural Small Molecule Mitigates Kidney Fibrosis by Targeting Cdc42-mediated GSK-3β/β-catenin Signaling. Adv Sci (Weinh). 2024 Apr;11(13):e2307850. doi: 10.1002/advs.202307850. Epub 2024 Jan 19. PMID: 38240457; PMCID: PMC10987128.
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